本发明提供了一种自杀基因纳米胶束，包括两亲性三嵌段聚合物和自杀基因，所述自杀基因纳米胶束为具有三层结构的复合体，所述聚亮氨酸构成所述复合体的内层，所述聚赖氨酸构成所述复合体的中间层，所述氨基聚乙二醇羧酸构成所述复合体的外层；其中，所述复合体的中间层还包括自杀基因质粒，所述自杀基因质粒分散在中间层的所述聚赖氨酸中。该自杀基因纳米胶束采用生物相容性和稳定性较好的三嵌段聚合物为载体材料制备自杀基因载体，该载体能很好的负载自杀基因质粒，转染效率较高，能提高自杀基因质粒在体内的稳定性，延长自杀基因质粒在体内的半衰期；本发明还提供了一种自杀基因纳米胶束的制备方法和应用。