本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种LAG‑3亲和肽N13、制备方法及其在抗肿瘤方面的应用。该亲和肽包括12个氨基酸，分子量为1634.8 Da，其序列具体DDFRVWWPNFPR。该肽可采用Fmoc固相多肽合成法制备，同时该肽可作为肿瘤治疗中的药物应用。本申请以真核蛋白rhLAG3‑Fc为靶分子，以hIgG1‑Fc为标签蛋白，通过噬菌体展示肽库高通量技术筛选出了LAG‑3胞外段的亲和肽N13。针对该肽，进一步的体外信号通路阻断试验和小鼠荷瘤试验表明，该肽在肿瘤治疗、延长生物体生存期方面具有较好地应用前景，为生物体肿瘤的免疫治疗提供了新的可能。