本发明公开了一种高效液相色谱法分离测定重酒石酸间羟胺及其异构体的方法，它是采用手性色谱柱并以正己烷、无水乙醇以及异丙胺的混合溶液为流动相；所述流动相中正己烷与无水乙醇以及异丙胺的体积比为（60～95）∶（5～30）∶（0.05～0.5）；所述手性色谱柱为以硅胶表面共价键合有直链淀粉‑三‑（3,5‑二甲苯基氨基甲酸酯）为填料的键合型手性色谱柱。本发明采用高效液相色谱法以及手性色谱柱，尤其是通过创造性劳动得到特殊的流动相，从而实现了重酒石酸间羟胺及其异构体的分离测定，最终保证了重酒石酸间羟胺的有效性和安全性。