本发明公开了兽用D型产气荚膜梭菌毒素的制备方法及其专用培养基。每100ml培养基由下述物质组成：大豆蛋白胨1～1.5g，酪蛋白胨1～1.5g，酵母浸粉0.5～0.75g，Na2HPO4·12H2O 0.5～0.75g、糊精1～1.5g，余量为水；所述培养基的pH值为8.0～8.5。所述D型产气荚膜梭菌毒素是将D型产气荚膜梭菌生产菌株接种于培养基中，收集培养物并离心，将上清液过滤即得。按本发明方法毒力最高可提至《中国兽用生物制品规程》制苗标准的45倍，产出投入比可提高至原传统工艺的30～225倍。并且，用其制备的类毒素疫苗在家兔和绵羊上的相应血清中和效价也分别提高至规程标准的8.3和13.3倍。