本发明公开了一种CHO细胞表达的重组牛病毒性腹泻病毒E2蛋白及亚单位疫苗的制备方法和应用，属于动物疫苗与兽用生物制品技术领域。其目的在于提供一种可大规模工业化生产牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗的制备方法。本发明提供的重组亚单位疫苗制备方法包括以下步骤：1)克隆包含E2蛋白编码基因的真核表达载体；2)转染CHO细胞，通过选择、筛选和驯化的方式得到悬浮稳定高效表达E2蛋白的CHO细胞株；3)发酵培养2)中所述的细胞株，纯化后得到重组E2蛋白；4)将重组E2蛋白与ISA 201 VG充分混匀得到重组亚单位疫苗。本发明提供的方法能够从细胞培养上清中收获目的蛋白，且产量高达500mg/L，不仅缩短蛋白纯化时间和简化疫苗生产步骤，也大大降低疫苗生产成本。