本发明提供了一种全基因组互作文库及其构建方法。该构建方法包括：步骤S1，利用引物序列将DNA‑蛋白交联复合物经酶切产生的末端进行连接，形成环状复合物；步骤S2，将环状复合物进行解交联，得到环状DNA；以及步骤S3，将环状DNA进行片段化文库构建，得到全基因组互作文库。该方法用一段外源的已知DNA序列对酶切产物片段末端进行连接，使DNA‑蛋白交联复合物形成环状复合物，然后再经过接交联将环状复合物中的蛋白去除，从而获得环状DNA，利用该环状DNA中所携带的外源已知DNA序列进行片段化文库构建，即可获得用于全基因组互作研究的全基因组互作文库，提供了一种简便的、操作性广的研究全基因组互作的方法。