本发明提供一种定位木本植物花粉管蛋白的免疫荧光方法及其试剂盒。所述试剂盒中包括固定液、酶解液、封闭液、一抗和二抗；所述固定液中含有PEPES、蔗糖、TritonX-100、多聚甲醛、NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4，所述酶解液中含有纤维素酶、离析酶、NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4，所述封闭液中含有牛血清白蛋白、NaCl、KCl、Na2HPO4和KH2PO4，所述一抗为目的蛋白抗体，所述二抗为FITC标记的山羊抗兔二抗。本发明以苹果花粉管为试材，通过酶解花粉管壁后，进行免疫荧光标记。采用本发明的方法可以直接、高效、灵敏、特异性的定位花粉管中的功能蛋白，为直观鉴定木本植物花粉管内功能蛋白的表达及定位提供技术体系。