本发明公开了一种鸭肝炎病毒的全悬浮培养方法，包括以下步骤：步骤1：鸭胚细胞衍生的传代细胞系的复苏与传代培养。步骤2：采用二阶培养法，向全悬浮培养的鸭胚细胞衍生的传代细胞接种鸭肝炎病毒，实现病毒大规模培养。步骤3：接毒后，每隔12h取样测定病毒的ELD50，在病毒ELD50达到最高时收获病毒并保存，得到培养后的鸭肝炎病毒。本发明的全悬浮培养方法提高了病毒培养规模和效率，符合未来疫苗生产的趋势，有广阔的应用前景及蕴含良好的经济效益。