本发明公开了一种荧光成像膜厚测量系统的标定装置及方法，包括试验台架，在试验台架上设有实验水池和安设在实验水池处的螺距头，在实验水池的上端或下端设有玻璃板，所述螺距头通过调距螺杆连接有实验板，所述实验板安设在试验水池内与玻璃板相对并平行设置，在试验台架上位于实验水池的两侧对称设有可调节的光源，在实验水池的上方或下方设有拍照设备，螺距头通过调距螺杆对实验板与玻璃板之间的距离，通过光源和拍照设备的工作对其进行采样。本发明采用高精度螺距头对液膜厚度进行控制，并且通过实验台架的设计确保液膜的光源的强度的准确性和均匀性，以及液膜的完整性，从而得到标准情况下，液膜厚度与亮度的标定关系。