本发明涉及分子生物学及领域。具体而言，本发明提供了一种用于测定核酸序列变异的数字PCR引物对、其组合物及其用于检测核酸序列变异的方法。本发明改进的数字PCR引物对的正向引物包含上游检测区和靶序列结合区，且靶序列结合区含有扩增决定位点和上游错配区，而上游检测区分别包含与探针具有相同序列的区域和与第二正向引物具有相同序列的的区域。与现有技术相比，本发明具有显著提高的灵敏度和高度特异性，并且大幅降低了引物和测试成本，具有极高的应用价值。