本发明提供一种依替米星杂质的合成方法，所述合成方法，步骤如下：(1)将依替米星溶于溶剂中，冷却至-5～0℃，加入BOC-ON(2-叔丁氧羰基亚氨基苯乙腈)，搅拌，加入水和乙酸乙酯，分液，取水相，浓缩，得浓缩液；(2)浓缩液以甲醇溶解，加入三乙胺，冷却至0～10℃，加入乙酸酐，搅拌，浓缩去溶剂；(3)浓缩液中加入盐酸，室温下搅拌，以氢氧化钠溶液调节pH，浓缩，以硅胶柱纯化分离出化合物3,2-N,N-二乙酰基依替米星；(4)将3,2-N,N-二乙酰基依替米星溶于溶剂中,加入亚硝酸钠，室温搅拌，浓缩,浓缩液加入20％氢氧化钠,升温回流,冷却,经大孔树脂除盐，分离，得杂质化合物。