本发明公开了一种Atg12基因敲除细胞系构建方法及其应用，提供了用于敲除人结肠癌细胞Atg12基因的SgRNA、构建CRISPR‑Cas9载体，以及构建Atg12基因敲除细胞系的方法。本发明筛选获得的Atg12基因靶点，从多个靶点中优选出来的活性最好的靶点，高效靶向Atg12基因，而且对F2～F5代细胞敲除分析，敲除效率很高，位点均已被切割断，100％成功敲除；蛋白表达分析无Atg12蛋白，此方法可广泛应用于Atg12基因功能研究和药物研发等方面。