本发明公开了一种结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6的制备方法。本发明提供了一种CFP10‑ESAT6重组融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该重组融合蛋白表达量高且为上清表达、活性好；纯化该重组融合蛋白后，经酶切、镍柱分离，洗脱，制备得到了结核分枝杆菌免疫原蛋白ESAT6；该方法制备得到的ESAT6蛋白的表达量高、抗原性好、活性好、纯度高，解决了ESAT6蛋白抗原性较差、可溶性不好、原核表达大部分为包涵体的问题，为结核病的早期诊断和新型疫苗的研制奠定了基础，具有广泛的应用前景。