本发明提出了一种基于Pacbio数据的MSI微卫星不稳定性检测方法，包括以下步骤：步骤一：测序错误的校正，利用ccs软件将Pacbio测序结果的subreads校正为CCS序列，min-passes>＝10；步骤二，检测MSI-PCR上下游引物的位置，并提取产物序列；步骤三，根据MSI核心区域旁邻20bp的特异性序列，进一步提取产物序列中的核心序列；步骤四，旁邻特异性序列是反向比对的，需要对核心序列进行反向互补转化；步骤五，根据给定的microsatellite motif，检测产物序列或核心序列中motif的重复次数以及motif之间的嵌合序列；步骤六，筛选重复次数>＝3的motif，保留它们之间的嵌合序列，作为MSI序列；步骤七，统计全部MSI序列的频次和频率，过滤频率小于5％的MSI序列；考虑到肿瘤的异质性，肿瘤组织样本可以放宽过滤阈值。