本发明公开了长链非编码RNA的测序文库构建方法及其应用。其中，该长链非编码RNA的测序文库构建方法包括：对所述待测样本进行去除rRNA处理，以便得到去除rRNA的产物；基于所述去除rRNA的产物进行逆转录处理，以便得到单链DNA，其中，所述逆转录处理的引物具有SEQ ID NO：1所示的序列；将所述单链DNA进行第一扩增处理，以便得到双链DNA；将所述双链DNA进行片段化处理，以便得到DNA片段；以及将所述DNA片段进行第二扩增处理，所述第二扩增的产物构成所述测序文库。该方法先通过rRNA去除探针去除rRNA，再进行逆转录，避免了大量的rRNA对mRNA和lncRNA逆转录的影响，并且，利用rRNA去除探针去除rRNA，rRNA的去除率高，方法的稳定性好。