本发明N‑乙酰氨基葡萄糖的分离和纯化方法，属于生物工程技术领域。本发明通过微生物发酵或者水解几丁质得到的含有N‑乙酰氨基葡萄糖的原料液，对原料液进行絮凝预处理，通过连续离心或压滤后去除微生物、蛋白质和多糖等悬浮固形物，获得澄清液。再经过双级离子交换层析去除带电荷的有机分子和无机盐等杂质。通过膜浓缩高效去除水分，提高目标产物的浓度。最后通过喷雾干燥或者进一步蒸发浓缩和结晶，最后干燥获得纯度超过99％的N‑乙酰氨基葡萄糖晶体。