本发明公开了利用木糖生产丁醇的工程菌株及其构建方法和应用。本发明提供了一种构建重组菌的方法，包括如下步骤：提高生产丁醇的出发菌的基因组中xylE、xylFGH、xylA、xylB、rpe、tktA、rpiA、talB的表达和/或活性，且抑制所述出发菌中的glk基因表达得到的菌。本发明的实验证明了本发明构建的重组菌可以利用木糖为碳源生产丁醇，将其发酵生物质，可以提高生物质的利用率，实现有效利用廉价生物质(多为木质纤维素)或其水解液。