本发明涉及间充质干细胞的驯化培养方法。具体涉及无血清驯化培养间充质干细胞的方法，包括如下步骤：采集脐带，剥取华通氏胶，加入完全培养基，于培养箱中静置培养，去除组织块并全量更换完全培养基继续进行培养，得到的细胞接下来进行消化；加胰蛋白酶溶液消化，加入完全培养基中和胰蛋白酶以终止消化过程，得到P0代细胞；将P0代细胞沉淀用含小于10%血清的驯化培养基重悬，于培养箱中静置培养，添加胰蛋白酶溶液消化，中和，得到P1代细胞；接着用依次降低胎牛血清浓度至最终为0%的驯化培养基进行处理，得到最终无血清体外驯化培养的间充质干细胞；任选的，继续用无血清驯化培养基进行培养、传代，本发明方法呈现说明书所述优良效果。