本发明公开了一种酶法制备甘油二酯的方法，属于油脂加工技术领域。第一步采用固定化脂肪酶催化油脂醇解，然后采用固定化甘油单酯脂肪酶催化第一步反应的副产物甘油单酯醇解。两步醇解反应结束后，甘油单酯被彻底去除，反应副产物仅为脂肪酸乙酯。相比于副产物为甘油单酯和脂肪酸，副产物为脂肪酸乙酯进行分子蒸馏纯化时，所需纯化温度更低，不仅可降低能量消耗，而且可避免纯化过程中脂类风险因子的产生，提高产品品质；同时降低了设备的要求，节约了生产维护成本，具有良好的经济效益和工业应用前景。