本发明属于生物技术领域，公开了一种评估冠状病毒跨物种传染风险的方法和试纸条及其应用。该方法是包括以下步骤：以已标记的某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白为探针，来捕获待测冠状病毒的完整或部分刺突蛋白；用固定的已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域，来捕获步骤(1)中未发生结合的探针；通过检测已知冠状病毒刺突蛋白S1结构域是否能捕获到未发生结合的探针，来判断待测冠状病毒的刺突蛋白能否与步骤(1)中已标记的某脊椎动物物种的完整或部分ACE2蛋白结合，进而评估待测冠状病毒通过ACE2受体感染上述脊椎动物物种的风险。本发明的检测对象不限于某种指定的冠状病毒，只要能与ACE2蛋白发生有效结合的，即可被检测到。