本发明公开了一种人源沉默信息调节因子4的活性荧光检测方法，该方法以含有配对的荧光基团与荧光淬灭基团、且含有3‑羟基‑3‑甲基戊二酰化赖氨酸残基的多肽为底物，1)将所述底物与人源沉默信息调节因子4孵育，脱去底物的赖氨酸残基上的3‑羟基‑3‑甲基戊二酰化修饰，得到无修饰的赖氨酸多肽；2)将所述的无修饰的赖氨酸多肽与蛋白水解酶裂解液孵育，从赖氨酸的C端裂解肽键；使荧光强度与上述的无修饰的赖氨酸多肽关联起来，该检测得到荧光强度与人源沉默信息调节因子4的酶活性具有相关性。这样的方法可应用于Sirtuin4调节剂的筛选，或是生物样本中的Sirtuin4活性检测，具有微型化、自动化、快速可靠等特点。