本发明公开了一种高效生产琥珀酸的重组大肠杆菌及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明敲除E.coli FMME‑N‑2产琥珀酸菌株的副产物编码基因得到菌株E.coli FMME‑N‑5(ΔfocA‑pflB‑ΔldhA‑Δpta‑ackA)；过表达来自产琥珀酸放线杆菌磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶pck和施式芽孢杆菌亚磷酸酯脱氢酶ptxD；将构建好的质粒pTrcHisA‑pck‑ptxD导入表达宿主E.coli FMME‑N‑5(ΔfocA‑pflB‑ΔldhA‑Δpta‑ackA)中，通过氨苄抗性平板筛选获得高效生产琥珀酸的工程菌E.coli FMME‑N‑5(ΔfocA‑pflB‑ΔldhA‑Δpta‑ackA)‑pck‑ptxD；此工程菌株在7.5L发酵罐上采用两阶段发酵策略，发酵96h，琥珀酸产量达到了137g/L,琥珀酸得率达到1g/g葡萄糖、生产强度为1.43g/L/h，副产物乳酸、甲酸不积累，乙酸1‑2g/L，具有一定的工业化生产潜力。