本发明公开了一种提高硫酸多粘菌素B发酵水平的方法，包括发酵配方及补料发酵工艺。发酵配方分为由发酵碳源及无机盐组成的基础配方和由发酵氮源组成的补料配方。补料发酵工艺，包括以下部分：a）发酵罐单消灭菌，b）补料瓶单消灭菌，c)在发酵的前中期，匀速补入由发酵氮源组成的补料液。通过本方法进行发酵培养得到的硫酸多粘菌素B，发酵效价平均可达11000u/mL以上，比原发酵水平提高了30%以上，且发酵液组分比例接近标准品液相图谱，易于工业化生产。