本发明公开了一种β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶159及其克隆表达与应用。通过基因工程手段将β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶159的基因构建在质粒pET‑28a(+)上，并转入E.coli BL21(DE3)中表达，该重组酶分子量大小为92kDa，通过对比分析，β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶159属于糖苷水解酶GH20家族。对该重组酶进行酶学性质研究表明，纯酶的比活力为16.67 U/mg，其最适温度为40℃，最适pH为9.0，在pH高于7的条件下能保持高于80%的酶活，与其他几丁质酶协同作用时，β‑N‑乙酰氨基葡萄糖苷酶159表现出较高的pH稳定性和协同效应,为高效制备N‑乙酰氨基葡萄糖提供了理论基础。