本发明公开了一种3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体和工程菌及应用，属于酶工程技术领域。本发明的分枝杆菌(Mycobacterium)LY‑1的3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体是将3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶的320位天冬氨酸突变成了酪氨酸，得到3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体KstD1；以pET32a为表达质粒，以大肠杆菌BL21为表达宿主，实现分枝杆菌LY‑1中3‑甾酮‑Δ1‑脱氢酶突变体的异源表达，重组菌大肠杆菌BL21‑pET32a‑KstD1能够在短时间内转化高浓度的C1,2‑位脱氢甾体化合物，且转化率达到98％，降低了生产成本，具有重要的工业应用价值。