本发明公开了一种烟草提取物残渣的二次提取方法，包括：将保藏编号为CGMCC NO.21313的微球菌ZY02的菌落接种至液体培养基中，制得种子液；将微球菌种子和残渣混溶物混合发酵，得到发酵残渣混溶物；过滤发酵残渣混溶物，得到第一滤液和第一固形物，对第一滤液离心，得到第二固形物；将第一固形物和第二固形物混合得到的第三固形物和无水乙醇震荡后过滤得到第二滤液；将上清液和第二滤液混合，得到的烟草二次提取液真空浓缩，得到浓缩液；对浓缩液进行回流提取处理，得到烘烤浓缩液；在烘烤浓缩液中加入无水乙醇，离心得到醇沉物；在醇沉物中加入1,2‑丙二醇。本公开的烟草提取物残渣的二次提取方法可有效提取烟草提取物残渣中的有益成分，得到新型烟草提取物。