本发明公开了一种基于磁纳米粒子磁化响应的线粒体温度测量方法及系统，属于纳米尺寸目标的温度测量领域，包括：(S1)将具有靶向到线粒体的磁纳米粒子作为探针，对细胞内的线粒体进行标记，得到待测样品；(S2)将待测样品放置于温度恒定且施加有交流磁场的待测区域中，并刺激线粒体使其工作；交流磁场由频率为f1和f2的磁场混合而成，f1≠f2；(S3)检测待测样品的交流磁化响应，并进行频谱分析，以提取各特征频率处的交流磁化响应；特征频率包括至少两个频率，且不包括f1和f2；(S4)对各特征频率处的交流磁化响应进行反演，得到线粒体的温度。本发明可以有效提高线粒体温度的测量精度，并实现实时测量。