本发明公开了一种“四步一锅煮”制备多肽侧链类似物的方法及其应用，属于化合物合成领域。具体操作过程如下：将含有一个裸露羧基的脂肪酸或一端羧基被保护的脂肪二酸的裸露羧基活化；活化后得到的粗反应液直接加入氨基酸进行缩合反应；待反应完全后，将得到的粗反应液中的脂肪酸‑氨基酸结合物或者脂肪二酸‑氨基酸结合物的裸露羧基活化；再次活化后的粗反应液中直接加入原料或进行缩合反应，最后再对终产品进行分离纯化处理而得到终产物多肽侧链类似物。本发明首次利用多步反应的“一锅煮”方法，具有操作简单，省工省时，成本更低，更绿色环保，产品质量高产率高，适合规模化生产等优点，且适合用于制备高纯度的胰岛素类似物。