本发明涉及一种293细胞补料培养基及其制备和应用，所述293细胞补料培养基包含氨基酸、维生素无机盐、葡萄糖、丙酮酸钠、次黄嘌呤、胸腺嘧啶核苷和水。相对于传统技术，本发明具备如下有益效果：本发明通过氨基酸、维生素和无机盐种类的选择，并搭配葡萄糖、丙酮酸钠、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷，形成特定配方的培养基配方，在采用生长培养基培养293细胞的过程中补加该培养基配方，能够很好地维持细胞密度增长并保持较高的细胞活率，同时维持细胞蛋白抗体浓度持续升高，同时该补料对于病毒的表达滴度亦有帮助作用。