本发明描述了一种高效率的测序文库的构建方法、引物组和试剂盒，构建方法包括：获得多个样本的DNA；利用第一引物、第二引物和第三引物对每个样本的DNA进行第一PCR扩增；将多个样本的扩增产物合并为一管；利用第四引物和第五引物对合并后的扩增产物进行第二PCR扩增，得到测序文库；第一引物为第一测序标签序列和扩增子特异性正向引物；第二引物为第二测序标签序列和扩增子特异性反向引物；第三引物第二测序接头序列、样本标签序列和第二测序标签序列；样本标签序列用于标记不同的样本；第四引物为第一测序接头序列和第一测序标签序列；第五引物为第二测序接头序列。根据本发明，能够提供一种高效率的测序文库的构建方法、引物组和试剂盒。