本发明属于烟草育种领域，涉及用于抗斑萎病烟草13号染色体背景筛选的引物组及其应用。提供用于抗斑萎病烟草育种背景筛选的PCR引物组合，包括第一PCR引物组和/或第二PCR引物组；所述第一PCR引物组由核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑3所示的三条引物组成；所述第二PCR引物组由核苷酸序列如SEQ ID NO:4‑6所示的三条引物组成；所述抗斑萎病烟草为供体亲本Polalta烟草和受体亲本K326烟草的杂交及回交后代。本发明的引物组可用于早世代筛选具有K326烟草背景的抗斑萎病烟草，极大地缩短K326抗斑萎病定向改良的育种周期，提高育种效率。