本发明涉及食品生物制造技术领域，尤其涉及利用霉菌发酵产物制备香菇提取物的方法及应用。该制备方法以霉菌在豆芽汁和麦芽汁混合培养基中的发酵产物对香菇进行分步酶解，包括依次采用米曲霉BAFS.Z4发酵液和黑曲霉BAFS.S2发酵液酶解香菇，再经灭酶后制得香菇提取物。本发明提供了一种水解度高、八碳化合物和含硫化合物种类和数量丰富的香菇提取物的制备方法，制得的香菇提取物风味突出、营养价值高。由该香菇提取物制备的调味料具有较好的咸味和鲜味感知，可添加到各类食品中，显著提升产品风味，同时达到减盐不减咸的目的。