本发明涉及透明质酸酶突变体及其在水解硫酸软骨素中的应用，属于生物工程技术领域。本发明的透明质酸酶突变体是将位于水蛭来源透明质酸酶的底物结合口袋中的氨基酸残基进行突变后得到的蛋白质，具体是以氨基酸序列SEQ ID NO.1所示的透明质酸酶为出发序列，将第65位的苯丙氨酸突变为丝氨酸；和/或将第180位苏氨酸突变为精氨酸。本发明应用定向进化技术和方法对透明质酸酶进行了改造，其中，所得双突变体对于硫酸软骨素的催化效率提高了15.9倍，并将其应用于低分子量硫酸软骨素的水解催化，具有重要的应用前景。