本发明涉及一种自聚焦超分辨率显微成像系统，包括激光器光路上依次设置的光纤耦合准直镜、扩束透镜组和反射镜，在反射镜的反射光路上依次设置有载物台、多层光学薄膜元件、显微物镜、分光镜和显微目镜，分光镜的成像光路上设置有管透镜和成像CMOS，CMOS与计算机处理系统相接。本发明可实现超分辨率成像,采用显微物镜，最终成像CMOS将采集到的图像信息传输至电脑进行图像处理，获得样品的超分辨图像，最小可分辨90nm的样品细节；在微光或弱光环境下也能实现微小细胞的观测，纳米级样品细节的采样成像；具有高性价比、材料环保、实施简单和实施成本低的优势，适用于微小样品的多样化信息采集检测。