本发明公开了一种组成型表达人透明质酸酶的毕赤酵母及其应用。本发明在保持人透明质酸酶PH‑20核心功能序列的基础上，首先对其信号肽序列进行替换，使rhPH‑20分泌表达水平提升20％；进一步对共翻译内质网转运途径进行针对性强化，使分泌表达提升48％；之后，通过强化内质网未折叠蛋白响应使分泌表达进一步提升31％。最终，经5‑L发酵罐培养，三步改造后的重组菌OE54‑ScHAC1分泌表达rhPH‑20产量达到19.82U·mL‑1，相较出发总共提升约9.38倍，为目前酵母体系组成型表达最高水平。