本发明提供了一种含有硫代磷酸酯键的RNA及其制备方法。其中，制备方法包括：利用RNA连接酶催化底物的3'羟基与5'硫代磷酸连接，形成含有硫代磷酸酯键的RNA；5'硫代磷酸包括含有硫代修饰的5'磷酸，硫代修饰包括5'磷酸的P‑OH或P=O中的氧原子被硫原子取代，相应地变为P‑SH或P=S；RNA连接酶包括RNA连接酶家族1、2或3中任意的一种或多种酶；包括：SEQ ID NO：1‑22等序列所示的RNA连接酶中的一种或多种。能够解决现有技术中的难以利用酶催化方法制备含有硫代磷酸酯键的RNA的问题，适用于RNA制备领域。