本发明公开了一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽及其应用，为以下任一或多个表位多肽，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑2的所示；或将SEQ ID NO.1‑2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.1‑2衍生的且保持SEQ ID NO.1‑2所示的蛋白功能的氨基酸序列。本发明通过设计O型口蹄疫病毒VP2蛋白的重叠肽段，利用酶联免疫斑点技术检测，筛选出功能性T细胞抗原表位多肽，并利用磁珠分选手段，分别纯化CD4+与CD8+T细胞，进一步检测筛选出的功能性T细胞抗原表位多肽所激活的T细胞类型，可用于制备O型口蹄疫病毒多表位疫苗。