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公开(公告)号：CN110845580A
公开(公告)日：2020-02-28
申请号：CN201911072955.7
申请日：2019-11-05
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
发明人： 汪洋 , 丁耀忠 , 李茜 , 张杰 , 爱斯纳非.科友斯.伍赛特 , 代军飞 , 李国秀 , 侯谦 , 马炳 , 刘永生 , 吕建亮 , 邵军军 , 刘新生 , 孙跃峰 , 潘丽 , 张永光
IPC分类号： C07K14/015 , C12N15/35 , C12N15/866 , G01N33/569
摘要： 本发明属于基因组装及免疫原性鉴定技术领域，公开了一种猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法，包括VP2基因的扩增，优化及重组供体质粒的构建；VP2重组穿梭质粒的构建与鉴定；重组杆状病毒的获得与鉴定；Western-blot鉴定VP2蛋白的表达；VP2蛋白的间接免疫荧光鉴定；PPV-AV30病毒纯化及鉴定；病毒样颗粒的组装及鉴定。本发明对蛋白进行翻译后加工修饰，展示目的蛋白的天然构象；本发明成功表达了PPV毒株AV-30的蛋白VP2，并且正确组装成了VLPs，与天然病毒粒子PPV-AV30相似，为下一步研究基于VLPs的亚单位疫苗或者制备嵌合型VLPs奠定了基础。
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公开(公告)号：CN117264026A
公开(公告)日：2023-12-22
申请号：CN202311025635.2
申请日：2023-08-15
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC分类号： C07K14/09 , C12N15/42 , A61K39/135 , A61P31/14
摘要： 本发明公开了一种O型口蹄疫病毒VP1蛋白T细胞表位多肽及其应用，为以下任一或多个表位多肽，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑3的所示；或将SEQ ID NO.1‑3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.1‑3衍生的且保持SEQ ID NO.1‑3所示的蛋白功能的氨基酸序列。本发明通过设计O型口蹄疫病毒的重叠肽段，利用酶联免疫斑点技术检测，筛选出功能性T细胞抗原表位多肽，利用IFN‑γ胞内细胞因子染色，进一步筛选确认能够有效诱导T淋巴细胞分泌IFN‑γ的肽段，可用于制备O型口蹄疫病毒多表位疫苗。
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公开(公告)号：CN112176104A
公开(公告)日：2021-01-05
申请号：CN202011070808.9
申请日：2020-10-09
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC分类号： C12Q1/70 , C12Q1/6844 , C12N15/11
摘要： 本发明公开了一种猪圆环病毒3型的可视化LAMP检测试剂盒，该试剂盒是包含有6条LAMP引物的LAMP反应液构成的检测体系。本发明的试剂盒以中性红为显色染料，使肉眼直观效果更加鲜明，阳性反应为粉红色，阴性反应为橘黄色，而且还实现了由试剂盒直接提供含有颜料的反应预混缓冲液的需求，这样不仅简化了操作程序，还有效避免污染发生。应用本发明的试剂盒进行检测，不仅能够以从临床样品中提取的DNA为扩增模板，而且还能够直接以全血或者血清为模板扩增，反应结果直接肉眼观察判断，具有良好的特异性和敏感性，需求设备简单(恒温热块即可)，操作便捷，不需要特殊技术人员，适于各种检测环境，尤其是现场使用。
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公开(公告)号：CN111778221A
公开(公告)日：2020-10-16
申请号：CN202010652309.4
申请日：2020-07-08
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC分类号： C12N7/01 , C12N15/866 , C07K19/00 , A61K39/295 , A61K39/125 , A61K39/135 , A61P31/14 , A61P31/20 , C12R1/93
摘要： 本发明根据计算机软件模拟结果，在猪细小病毒PPV VP2蛋白表面Loop2区和Loop4区后分别嵌入SAT2 FMDV B细胞表位(VYTKAAAAIRGDRAALAAKYADTNHTLPPTFNFGYVTVDK)，在N端嵌一个T细胞表位(NVQEGRRKHTDVAFLLDRST)。根据昆虫细胞嗜性优化合成嵌合基因GS1925OP，克隆到载体pFastBacTMDual上，转化大肠杆菌DH10Bac，获得重组杆粒rBacmidNT1L2B4B，转染sf9细胞，收获重组杆状病毒rBacNT1L2B4B，用其感染HF细胞，使用间接免疫荧光IFA针对嵌合表位和VP2蛋白进行检测，具有特异性荧光。Western-blot针对B、T细胞表位和VP2蛋白进行检测，在70KDa出现一条特异性条带。透射电镜TEM观察，重组蛋白NT1L2B4B能够自我组装成病毒样颗粒。本发明可以应用在为南非2型口蹄疫制备储备疫苗，并能在此基础上达到同时预防南非2型口蹄疫和猪细小病的目的。
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公开(公告)号：CN111087452A
公开(公告)日：2020-05-01
申请号：CN201911309242.8
申请日：2019-12-18
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
摘要： 本发明公开了一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，以PCV2毒株基因组为参考序列，在PCV2b的Cap蛋白编码基因上游偶联SUMO促溶表达标签编码基因，在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，优化基因，重组至PUC57质粒，以重组质粒为模板，设计特异性引物，经PCR扩增后产物克隆入pMAL-C4x原核表达载体，构建重组质粒，转入大肠杆菌进行诱导、纯化。本发明成功构建了pMAL-MBP-HisSUMO-Cap重组表达载体，MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白在BL21(DE3)中可实现可溶性表达，纯化后MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白作为免疫原，能与PCV2b阳性猪血清、兔抗MBP-tag多克隆抗体和免疫小鼠抗血清均能发生特异性反应，表明其具有较好的免疫原性，为PCV2b诊断试剂盒的研发奠定了理论基础。
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公开(公告)号：CN117264026B
公开(公告)日：2024-04-12
申请号：CN202311025635.2
申请日：2023-08-15
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC分类号： C07K14/09 , C12N15/42 , A61K39/135 , A61P31/14
摘要： 本发明公开了一种O型口蹄疫病毒VP1蛋白T细胞表位多肽及其应用，为以下任一或多个表位多肽，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑3的所示；或将SEQ ID NO.1‑3的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.1‑3衍生的且保持SEQ ID NO.1‑3所示的蛋白功能的氨基酸序列。本发明通过设计O型口蹄疫病毒的重叠肽段，利用酶联免疫斑点技术检测，筛选出功能性T细胞抗原表位多肽，利用IFN‑γ胞内细胞因子染色，进一步筛选确认能够有效诱导T淋巴细胞分泌IFN‑γ的肽段，可用于制备O型口蹄疫病毒多表位疫苗。
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公开(公告)号：CN117304271A
公开(公告)日：2023-12-29
申请号：CN202311262920.6
申请日：2023-09-27
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC分类号： C07K7/08 , C12N15/12 , A61K39/135 , A61P31/14 , G01N33/569
摘要： 本发明公开了一种O型口蹄疫病毒VP2蛋白T细胞表位多肽及其应用，为以下任一或多个表位多肽，所述表位多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑2的所示；或将SEQ ID NO.1‑2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加由SEQ ID NO.1‑2衍生的且保持SEQ ID NO.1‑2所示的蛋白功能的氨基酸序列。本发明通过设计O型口蹄疫病毒VP2蛋白的重叠肽段，利用酶联免疫斑点技术检测，筛选出功能性T细胞抗原表位多肽，并利用磁珠分选手段，分别纯化CD4+与CD8+T细胞，进一步检测筛选出的功能性T细胞抗原表位多肽所激活的T细胞类型，可用于制备O型口蹄疫病毒多表位疫苗。
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公开(公告)号：CN116439195A
公开(公告)日：2023-07-18
申请号：CN202310224922.X
申请日：2023-03-09
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC分类号： A01K67/02
摘要： 本发明公开了一种口蹄疫病毒小鼠感染模型的构建方法及其应用，本模型通过对I型干扰素受体缺失的C57/BL6小鼠腹部进行皮下注射的方式感染口蹄疫病毒；采用本发明方法建立的FMDV感染小鼠模型，攻毒后实验小鼠临床症状明显、典型、可重复性高，可用于FMDV致病机制和免疫机理研究，以及抗病毒药物和疫苗的研发，完善FMDV防控体系。
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公开(公告)号：CN113564276A
公开(公告)日：2021-10-29
申请号：CN202110550305.X
申请日：2021-05-19
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC分类号： C12Q1/70 , C12Q1/6844 , C12N15/11
摘要： 本发明公开了FMDV可视化RT‑LAMP检测方法的建立。以合成的39条3D‑T7序列的体外RNA转录本为模板，对RT‑LAMP引物、引物浓度、反应时间、反应温度和显色剂等进行了筛选。建立了FMDV的RT‑LAMP检测方法，总体系为20μL，包括RT‑LAMP缓冲液15.2μL，BstAMV酶混合液1.5μL，外引物F3和B3各0.04μL(100μM)，内引物FIP和BIP各0.5μL(100μM)，环引物Floop和Bloop各0.11μL(100μM)，中性红1μL(500μM)，模板1μL。反应时间55min，反应温度65℃。反应结束后，若反应管溶液变为粉红色判为阳性，若为橘黄色则判为阴性。该方法特异性强，不与BVDV、ORFV、SPPV/GTPV、SVDV、BTV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV和PCV等病毒发生反应。建立的FMDV可视化RT‑LAMP方法为基层现场检测奠定了基础，以达到快速诊断FMDV的目的。
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公开(公告)号：CN111778219A
公开(公告)日：2020-10-16
申请号：CN202010651527.6
申请日：2020-07-08
申请人： 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC分类号： C12N7/01 , C12N15/866 , C07K19/00 , A61K39/295 , A61K39/125 , A61K39/135 , A61P31/14 , A61P31/20 , C12R1/93
摘要： 本发明根据计算机软件模拟结果，在猪细小病毒PPV VP2蛋白表面Loop2区嵌入SAT2 FMDV B细胞表位(VYTKAAAAIRGDRAALAAKYADTNHTLPPTFNFGYVTVD)。根据昆虫细胞嗜性优化合成嵌合基因GS1921OP，克隆到载体pFastBacTMDual上，转化感受态细胞DH10Bac，获得重组杆粒rBacmidL2B，转染sf9细胞收获得重组杆状病毒rBacL2B。使用间接免疫荧光针对嵌合表位和VP2蛋白进行检测，具有特异性荧光。West ern Blot针对嵌合表位和VP2蛋白进行检测，在67KDa出现一条特异性条带。重组嵌合蛋白L2B能够自我组装成病毒样颗粒(Virus-like Particles，VLPs)。本发明可应用在为南非2型口蹄疫制备储备疫苗，并能在此基础上达到同时预防南非2型口蹄疫和猪细小病的目的。
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