本发明提供一种近红外荧光四面体探针及其制备方法以及在近单细胞水平肿瘤成像中的应用，所述制备方法包括以下步骤：1)将边长为20碱基对(bp)的DNA四面体纳米结构修饰上疏水性基团，制得具有精确形貌尺寸特定疏水空腔的DNA纳米笼；2)提供一种具有近红外发光性质的疏水荧光染料；以及3)将所述DNA纳米笼和所述疏水荧光染料通过震荡或超声混合，使所述疏水荧光染料进入所述DNA纳米笼的疏水空腔并被封装在内，即可制得一种近红外荧光四面体探针。根据本发明方法制备的近红外荧光四面体探针具有较高的亮度、较好的稳定性以及良好的生物安全性，可以以接近单细胞水平的灵敏度对肿瘤进行成像，具有良好的医学应用前景。