本发明涉及食品检测技术领域，具体公开了一种禽分枝杆菌副结核亚种LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法和应用，通过所述引物组包括内引物、外引物和环引物；所述内引物由FIP和BIP组成，所述外引物由F3和B3组成，所述环引物由LF和LB组成。本发明提供的引物能特异性检测生鲜乳中的禽分枝杆菌副结核亚种，可视化灵敏性在5.01×101CFU/mL，琼脂糖凝胶电泳检测灵敏度为5.01×101CFU/mL，本发明提供引物组的特异性高。