本发明属于多肽药物领域，具体涉及一种抗菌订书肽及其制备方法和应用。本发明以Rink amide MBHA氨基树脂作为固相载体，根据模板多肽SLP‑0:Ac‑LKRVWKRVFKLLKRYWRQLKKPVR‑NH2氨基酸序列进行修饰改造,其中氨基酸残基18Q和22P被S5替换并环合，得到目标订书肽。本发明的订书肽可显著提高对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌的抑制活性，在临床耐药菌感染等相关疾病治疗中具有潜在的应用价值。