本发明提供一种发光底物的制备方法。所述制备方法包括：(1)在强碱存在下，将化合物1与Br‑R1‑OH反应，得到中间体；(2)在强碱存在下，将步骤(1)得到的中间体与1,3‑丙烷磺内酯反应，得到所述发光底物；步骤(1)和步骤(2)所述反应的温度各自独立地为‑20～30℃；步骤(1)所述强碱为有机碱和/或无机碱；步骤(1)所述有机碱包括甲醇钠、乙醇钠、叔丁醇钾、叔丁醇钠、1,8‑二氮杂双环[5.4.0]十一碳‑7‑烯、1,5‑二氮杂双环[4.3.0]‑5‑壬烯或4‑二甲氨基吡啶中的至少一种。本发明中，所述制备方法得到的发光底物收率和纯度高，且原料易得，反应条件温和，成本低。