本发明属于草本植物次生代谢活性成分提取分离技术领域，具体涉及一种以废弃烟叶为原料制备酪氨酸酶抑制活性成分的制备方法及应用。本发明以废弃烟叶为原料，经提取、萃取、分离和纯化得到7个成分：羟基黏霉菌酮、(6R,9S)‑3‑羰基‑α‑紫罗兰醇、(+)‑去氢催吐萝芙木醇、(S)‑3‑羟基‑紫罗兰酮、日齐素、(4R,6S,E)‑3,4,6‑三羟基‑4,8,8‑三甲基环辛烯醇‑2‑烯‑1‑酮、新植二烯。以本发明制备的7个成分纯度高，制备方法具有操作简单、周期短、成本低、可减少废弃烟叶造成的环境污染且能实现废弃物高值化利用的特点。本发明制备的废弃烟叶中的7个成分对酪氨酸酶具有显著抑制作用，可用于制备酪氨酸酶抑制剂。