本发明属于基因工程技术领域，涉及一种结核杆菌小分子热休克蛋白Hsp16‑3(以下简称Hsp16‑3)过表达的结核分枝杆菌国际标准无毒株H37Ra菌(以下简称H37Ra菌)菌株的构建及其应用。首次利用电穿孔技术，将构建的大肠杆菌‑结核杆菌重组穿梭质粒载体pMV361‑Hsp16‑3，转入H37Ra菌，筛选并鉴定，确定成功构建的菌株，为Hsp16‑3基因过表达的H37Ra菌株。本发明构建的Hsp16‑3过表达的H37Ra菌，增强了Hsp16‑3基因的表达，将提升H37Ra菌对机体的免疫反应，为探索研究Hsp16‑3对H37Ra菌的致病性、免疫保护作用等方面的调控作用，以及新型结核病疫苗研发奠定基础。