本发明提供了一种球虫单个卵囊全基因组DNA扩增和基因组测序的方法，属于寄生虫检测技术领域，所述方法包括下列步骤：S1）纯化球虫卵囊；S2）单卵囊分离及卵囊壁破碎；S3）球虫全基因组DNA扩增；S4）全基因组扩增产物纯化；S5）WGA产物检测；S6）高通量测序分析。本发明利用显微镜和毛细管针精准地分离出单个球虫卵囊，保证了卵囊的纯度；在显微镜下，利用毛细管针刺破球虫卵囊壁，释放出四个孢子囊，未对球虫DNA链造成损伤；经过全基因组扩增获得高质量的扩增基因组，达到第二代及第三代测序要求，球虫基因组达到染色体草图级别且完整度在90%以上。