本公开提供了一种用于鉴定多花黄精品种的引物组、试剂盒及其应用，属于分子鉴定技术领域。该引物组包括：第1引物对至第50引物对，每个引物对均包括正向引物和反向引物，第1引物对的正向引物、第1引物对的反向引物至第50引物对的正向引物和第50引物对的反向引物依次如序列表中SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：100所示。利用该引物组可通过多重PCR扩增和高通量测序获得受检样本的DNA指纹数据，再通过比较受检样本间的DNA指纹数据得到品种鉴定结论，且准确率和数字化程度均较高，可以通过序列分析软件一次性比对成百上千个受检样本，快速获得品种鉴定结论，这能显著提高多花黄精品种鉴定的准确率和效率。