本发明公开了一种生产乳糖‑N‑四糖的大肠杆菌及基于其的双菌耦合发酵方法。本发明首先在大肠杆菌中构建了LNT生物合成途径；然后对双质粒系统进行组合优化，构建了四株工程菌，并筛选出EP3菌株(含有galT1‑SP ase和galE‑Cvβ3GalT表达框)与酵母耦合发酵产LNT能力最优，可产生25.2g/L LNT，其摩尔转化率(mol/mol LNT II)为71.22％。接着对生产体系进行优化，比较UTP和UMP作为辅因子对LNT合成的影响，在仅添加20mM UMP作为辅因子时，即可生成29.4g/L LNT，其摩尔转化率(mol/mo l LNT II)为83.09％。最后补料分批培养EP3菌株，经全细胞催化后产生39.6g LNT。本发明为高效廉价生产LNT提供了一种新的策略。