本发明涉及一种毕赤酵母表达重组AspN蛋白的工艺方法，具有以下步骤：S1：序列设计：将AspN蛋白的DNA序列根据毕赤酵母mRNA特点进行优化，同时调整DNA序列使AspN的氨基酸序列发生定点突变，并在DNA序列上添加纯化标签和酶切位点；S2：菌株表达：将S1得到的序列与质粒连接，转化到毕赤酵母基因组中，将重组毕赤酵母菌株转化到大肠杆菌中进行发酵表达；S3：AspN蛋白获取：将S2发酵得到的发酵液进行纯化得到重组AspN蛋白；S4：酶活性检测：将得到的重组AspN蛋白进行酶活检测，确定其酶切效果。本发明利用毕赤酵母表达重组AspN蛋白，为构建、发酵和纯化内肽酶AspN提供了一种新的工艺方法。