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公开(公告)号：CN114196642B
公开(公告)日：2023-12-05
申请号：CN202111324471.4
申请日：2021-11-10
申请人： 浙江大学杭州国际科创中心
摘要： 本发明公开了一种谷氨酸脱氢酶变体及其在制备L‑氨基酸中的应用，该谷氨酸脱氢酶变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第71位，第92位，第143位，第144位，第145位，第146位，第175位，第187位，第352位，第355位进行单点突变或多点组合突变获得。本发明以来源于Clostridium difficile的谷氨酸脱氢酶为基础，通过理性设计的分子改造方法，来解决其对非天然底物没有酶活或酶活较低的问题，获得可以催化制备除天然产物L‑谷氨酸以外的多种L‑氨基酸的突变体，原料转化率和产品ee值均大于99％。
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公开(公告)号：CN113462677B
公开(公告)日：2023-02-10
申请号：CN202110867862.4
申请日：2021-07-29
申请人： 浙江大学杭州国际科创中心
摘要： 本发明公开了一种α亚基突变的腈水合酶突变体及其应用。本发明通过蛋白质分子改造，显著提高了源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)的腈水合酶在基因工程菌E.coli BL21(DE3)中活性表达能力。以丙烯腈为底物，本发明的腈水合酶突变体的催化活力显著提高，单位LB摇瓶发酵液的酶活最高为突变体NHAB‑A2M，为初始型NHAB的1.7倍；突变体NHAB‑A14M的酶活提高了1.4倍，其热稳定性更是显著提高，在45℃条件下热处理1h后，残余酶活为78％，是野生型的4.8倍。
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公开(公告)号：CN113088500B
公开(公告)日：2022-08-30
申请号：CN201911337691.3
申请日：2019-12-23
申请人： 浙江大学
摘要： 本发明公开了一种谷氨酸脱氢酶突变体、编码基因及制备L‑草铵膦的方法。本发明通过定向进化与半理性设计相结合的分子改造方法，显著提高了源于Clostridium difficile的谷氨酸脱氢酶对PPO的催化活力；解决了还原胺化法制备L‑草铵膦工艺中NADH特异性谷氨酸脱氢酶酶活几乎没有酶活的问题；本发明谷氨酸脱氢酶突变体对PPO的催化活力显著提高，LB培养基摇瓶发酵的酶活最高达16.14U/mL；本发明谷氨酸脱氢酶突变体在L‑草铵膦的制备中，表现出良好的催化效率，底物转化率>99％，L‑草铵膦浓度最高达83.6g/L，ee值>99％，具有非常大的工业应用前景；本发明成功的解决了氨化还原反应制备L‑草铵膦过程中的生物催化剂活力低和辅酶稳定性的关键问题，为实现该工艺的工业化应用奠定了基础。
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公开(公告)号：CN113444714B
公开(公告)日：2022-06-21
申请号：CN202110868344.4
申请日：2021-07-29
申请人： 浙江大学杭州国际科创中心
摘要： 本发明公开了一种β亚基突变的腈水合酶突变体及其应用。一种腈水合酶的β亚基突变体，由野生型β亚基序列经突变所得，野生型β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，突变位点为L25F、G27Y、N59P和A173N中的至少一个。本发明通过蛋白质分子改造，显著提高了源于博得特氏菌DSM 12804(Bordetella petrii DSM12804)的腈水合酶在基因工程菌E.coli BL21(DE3)中的稳定性表达。以丙烯腈为底物，本发明的腈水合酶突变体在45℃下热稳定性显著提高，突变体NHAB‑B4M为NHAB的5.4倍，并且在100g/L丙烯酰胺溶液中的耐受性提高了3.6倍，具有非常大的工业应用前景。
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公开(公告)号：CN112553285A
公开(公告)日：2021-03-26
申请号：CN202011569978.1
申请日：2020-12-25
申请人： 浙江大学杭州国际科创中心
摘要： 本发明公开了一种ω‑转氨酶的应用及生物酶法去消旋化制备L‑草铵膦的方法。所述ω‑转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该ω‑转氨酶具有催化D‑草铵膦转化为2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸的活性，以D，L‑草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L‑草铵膦，所述酶催化体系包括：用于将D‑草铵膦转化为2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸的ω‑转氨酶，以及用于将2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸转化为L‑草铵膦的谷氨酸脱氢酶。本发明方法能够直接以D，L‑草铵膦为原料进行去消旋化，无需昂贵的拆分试剂；辅原料异丙醇可转化为副产物异丙胺，异丙胺可回收且是重要的农药化工原料，因此本发明工艺总体成本更低，具备工业化应用潜力。
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公开(公告)号：CN107502647B
公开(公告)日：2020-12-15
申请号：CN201710834958.4
申请日：2017-09-15
申请人： 浙江大学
摘要： 本发明公开了一种生物酶法去消旋化制备L‑草铵膦的方法，该方法以D,L‑草铵膦为原料，经酶催化体系催化获得L‑草铵膦，所述酶催化体系由D‑氨基酸氧化酶、氨基酸脱氢酶和辅酶再生系统组成。本发明方法以外消旋D,L‑草铵膦为原料，利用D‑氨基酸氧化酶将D‑草铵膦氧化为2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸，L‑草铵膦因不参与反应而被完全保留；而2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸又被氨基酸脱氢酶催化还原为L‑草铵膦，进而实现了D,L‑草铵膦的原位去消旋化，得到的L‑草铵膦中无其他副产物，产品总收率≥99％，光学纯度可超过99％。
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公开(公告)号：CN108753858B
公开(公告)日：2020-10-23
申请号：CN201810587713.0
申请日：2018-06-08
申请人： 浙江大学
IPC分类号： C12P13/04
摘要： 本发明公开了一种L‑氨基酸的生产方法，该方法包括：以1,ω‑二胺或其盐为氨基供体，在底物α‑酮酸或其盐存在的条件下，利用转氨酶催化1,ω‑二胺与底物发生转氨反应，得到L‑氨基酸；所述1,ω‑二胺为1,4‑丁二胺、1,5‑戊二胺或1,6‑己二胺；所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑6所示。本发明以1,ω‑二胺及其盐为氨基供体，α‑酮酸及其盐为底物，通过特定的转氨酶催化底物发生转氨反应，能够将底物完全转化为L‑氨基酸，原料利用率和转化率高，供体摩尔当量仅为1.1时，转化率可达100％。
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公开(公告)号：CN106916857B
公开(公告)日：2019-08-27
申请号：CN201710138579.1
申请日：2017-03-09
申请人： 浙江大学
IPC分类号： C12P13/04
摘要： 本发明公开了一种生产L‑草铵膦的方法，该方法以2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，经酶催化体系催化获得L‑草铵膦，所述酶催化体系由γ‑氨基丁酸/α‑酮戊二酸转氨酶、谷氨酸脱氢酶和辅酶再生系统组成。本发明方法在利用转氨酶催化活力高、立体选择性强等优点的同时，解决了转氨酶催化反应不彻底的难题，使催化反应能完全地将底物2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸转化为L‑草铵膦，转化率可达100％；本发明方法的最终产品中没有副产物a‑酮戊二酸的积累，反应结束时产品中其他物质如原料谷氨酸的残留量极低，从而极大地简化了L‑草铵膦的后续精制工艺，提高了产品总收率。
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公开(公告)号：CN109651433A
公开(公告)日：2019-04-19
申请号：CN201811518045.2
申请日：2018-12-12
申请人： 浙江大学
IPC分类号： C07F9/30 , C07C51/42 , C07C59/105
摘要： 本发明公开了生产L-草铵膦的酶反应液中L-草铵膦和葡萄糖酸的分离方法，该方法包括：取酶催化法生产L-草铵膦后获得的含有L-草铵膦和葡萄糖酸的酶反应液，减压浓缩后，得到浓缩液I；浓缩液I经降温、搅拌、结晶，过滤，得到滤液I和葡萄糖酸铵；向滤液I中加入无机酸，减压浓缩后，得到浓缩液II；向浓缩液II中加入有机溶剂，持续搅拌，过滤，烘干滤饼后，得到L-草铵膦。
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公开(公告)号：CN109485673A
公开(公告)日：2019-03-19
申请号：CN201811519965.6
申请日：2018-12-12
申请人： 浙江大学
IPC分类号： C07F9/30 , C07C51/47 , C07C59/105
摘要： 本发明公开了一种用离子交换树脂分离L-草铵膦和葡萄糖酸的方法，该方法包括：取含L-草铵膦和葡萄糖酸的L-草铵膦粗液，调节粗液的pH值至1～4，得到进料液；将进料液加入至装有强酸型阳离子交换树脂的交换柱中，进行色谱分离，收集含葡萄糖酸的流出液；在交换柱底部检测到L-草铵膦的浓度达到进料液中L-草铵膦浓度的5～10％时，停止加入进料液；然后，先用去离子水洗涤树脂，再用碱液作洗脱剂解吸L-草铵膦，收集洗脱液，得到L-草铵膦溶液。本发明先调节L-草铵膦粗液的pH值，再利用强酸型阳离子交换树脂进行色谱分离，实现了L-草铵膦和葡萄糖酸的高效分离，分离效率高。
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