公开(公告)号：CN101691560B

公开(公告)日：2011-08-31

申请号：CN200810220160.1

申请日：2008-12-19

申请人： 华南理工大学

发明人： 潘力 ,  杨慧林 ,  苗小康 ,  崔翠

IPC分类号： C12N1/21 ,  C12N15/54 ,  C12N15/70 ,  C12N9/10 ,  C12R1/19

摘要： 本发明公开了大肠杆菌及其可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法，该方法包括如下几个步骤：(1)根据茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原基因的核苷酸序列，设计PCR引物进行PCR扩增，克隆到原核表达载体pET22b(+)中，构建表达载体pET22b-proMTG，转化为大肠杆菌E.coli BL21/proMTG，该菌株保藏号为CCTCC M 208240；(2)可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原；(3)转谷氨酰胺酶酶原的激活；(4)高密度发酵；(5)蛋白纯化工艺。本发明方法的转谷氨酰胺酶产量及比活力达到直接在大肠杆菌中表达形成包涵体并经变性及复性生产该酶的水平，而且发酵生产工艺更简单。

公开(公告)号：CN102586167B

公开(公告)日：2013-07-24

申请号：CN201210052578.2

申请日：2012-03-01

申请人： 华南理工大学 ,  广州市澳键丰泽生物科技有限公司

发明人： 潘力 ,  王坤 ,  杨慧林 ,  钟景儒

IPC分类号： C12N1/21 ,  C12R1/125

摘要： 本发明公开了一株重组的枯草芽孢杆菌及由其生产转谷氨酰胺酶的方法，该重组菌株由以下步骤构建得到：(1)通过融合PCR将P43启动子+信号肽基因与subtilisin-like protease基因连接，再将融合PCR扩增产物转化入枯草芽孢杆菌WB800，得到枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S；(2)PCR扩增茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原基因，然后将扩增产物转化入枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S中得到枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG。将枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800S/proMTG发酵、纯化，得到可溶性的转谷氨酰胺酶。本发明方法可以在发酵液上清中直接获得具有生物活性的转谷氨酰胺酶，省去了繁琐的细胞破碎、纯化后激活酶原等过程，简化了发酵生产工艺。

公开(公告)号：CN102952815A

公开(公告)日：2013-03-06

申请号：CN201210029597.3

申请日：2012-02-10

申请人： 华南理工大学

发明人： 潘力 ,  王坤 ,  杨慧林

IPC分类号： C12N15/54 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12N9/10 ,  C12R1/19

摘要： 本发明公开了利用转谷氨酰胺酶酶原生产微生物转谷氨酰胺酶的方法，包括如下步骤：（1）茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原基因扩增，在酶原与成熟肽之间引入牛肠激酶的识别序列DDDDK；（2）基因克隆构建表达载体，转化大肠杆菌E.coliBL21（DE3）为工程菌E.coliBL21/proMTG，菌株保藏号为CCTCCM208240；（3）可溶性诱导表达转谷氨酰胺酶酶原；（4）亲和层析纯化蛋白，获得转谷氨酰胺酶酶原；（5）采用牛肠激酶激活酶原为成熟的转谷氨酰胺酶。本发明获得的转谷氨酰胺酶生物活性高；简化了发酵生产工艺，可以特异性完整切除转谷氨酰胺酶酶原序列，不会因非特异性切割或长时间切割导致酶的降解。

公开(公告)号：CN102586167A

公开(公告)日：2012-07-18

申请号：CN201210052578.2

申请日：2012-03-01

申请人： 华南理工大学 ,  广州市澳键丰泽生物科技有限公司

发明人： 潘力 ,  王坤 ,  杨慧林 ,  钟景儒

IPC分类号： C12N1/21 ,  C12N9/10 ,  C12N15/63 ,  C12R1/125

摘要： 本发明公开了一株重组的枯草芽孢杆菌及由其生产转谷氨酰胺酶的方法，该重组菌株由以下步骤构建得到：(1)通过融合PCR将P43启动子+信号肽基因与subtilisin-like protease基因连接，再将融合PCR扩增产物转化入枯草芽孢杆菌WB800，得到枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S；(2)PCR扩增茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原基因，然后将扩增产物转化入枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S中得到枯草芽孢杆菌B.subtilis WB800S/proMTG。将枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800S/proMTG发酵、纯化，得到可溶性的转谷氨酰胺酶。本发明方法可以在发酵液上清中直接获得具有生物活性的转谷氨酰胺酶，省去了繁琐的细胞破碎、纯化后激活酶原等过程，简化了发酵生产工艺。

公开(公告)号：CN101691560A

公开(公告)日：2010-04-07

申请号：CN200810220160.1

申请日：2008-12-19

申请人： 华南理工大学

发明人： 潘力 ,  杨慧林 ,  苗小康 ,  崔翠

IPC分类号： C12N1/21 ,  C12N15/54 ,  C12N15/70 ,  C12N9/10 ,  C12R1/19

摘要： 本发明公开了大肠杆菌及其可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原的方法，该方法包括如下几个步骤：(1)根据茂原链霉菌转谷氨酰胺酶酶原基因的核苷酸序列，设计PCR引物进行PCR扩增，克隆到原核表达载体pET22b(+)中，构建表达载体pET22b-proMTG，转化为大肠杆菌E.coli BL21/proMTG，该菌株保藏号为CCTCC M 208240；(2)可溶性表达转谷氨酰胺酶酶原；(3)转谷氨酰胺酶酶原的激活；(4)高密度发酵；(5)蛋白纯化工艺。本发明方法的转谷氨酰胺酶产量及比活力达到直接在大肠杆菌中表达形成包涵体并经变性及复性生产该酶的水平，而且发酵生产工艺更简单。